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对蛇尾草水提物草酸钙结晶动力学和晶体形状的体外影响:潜在的抗结石机制剖析

发布时间:2022-08-06 07:45:33 来源:华体会体育官网 | 浏览:8

内容摘要:  Ceterach officinarum Willd 是一种遍及欧洲的植物,在意大利南部用作利尿剂。信任C的优点。铁皮水提物在医治草酸钙肾结石方面被广泛持有。但是,关于其抗锂效果的实践机制知之甚少

  Ceterach officinarum Willd 是一种遍及欧洲的植物,在意大利南部用作利尿剂。信任C的优点。铁皮水提物在医治草酸钙肾结石方面被广泛持有。但是,关于其抗锂效果的实践机制知之甚少。咱们在这项体外研讨中的成果证明晰C. officinarum水提物作为抗氧化剂的杰出来历,具有很高的抗氧化效果。咱们的成果也证明晰C的首要影响。药草水提物在体外诱导草酸钙结晶动力学和晶体形状,显现其在肾结石构成和/或消除中的关键效果。咱们标明,逐步添加的C剂量。officinarum水提物引起一系列的影响。首要查询到对草酸钙一水合物 (COM) 成长和集合的强壮按捺效果。C. _ 厚朴水提取物在影响成核方面好像也十分有用,添加了 COM 晶体的数量并减小了其巨细,COM 晶体以剂量依靠的办法逐步变薄、变圆和洼陷。已知这些形状润饰的 COM 晶体与肾小管细胞的粘附性较低,并且更简单经过尿道排出,然后避免肾结石构成。此外,C . officinarum水提取物促进草酸钙二水合物 (COD) 的构成,而不是一水合物,因而,在运用的最高浓度下,仅查询到 COD 晶体,数量明显添加,其巨细明显减小,呈剂量依靠性. 此外,AFM 剖析使咱们能够提醒C的存在。COD 和改性 COM 晶体外表上的officinarum成分。晶体外表吸附的组分显现出与总水提取物具有类似的活性,这标明能够将晶体改性导向 COD 办法的触发要素。在尿石症发病机制中,COD 晶体的风险性低于 COM 办法,因为它们对肾小管细胞的亲和力较低。咱们的成果关于了解辅导由C诱导的润饰的机制很重要。厚朴关于结晶进程。依据这些数据,在人肠上皮细胞体外模型中未查询到不良毒性效果, C . 厚朴水提取物或许是医治尿石症的一种有吸引力的天然疗法。

  尿石症是一种常见且常见的人类病理 [ 1 ],其特点是复发率高、病理生理根底杂乱、病因多[ 2 ]。尿液一般含有丰厚的矿藏质,简单构成结石,而在健康个别中,这种矿藏质会经过削减晶体集合而遭到天然按捺 [ 3 ]。最常见的尿石症会发生草酸钙 (CaOx) 晶体。结石的构成阅历了各种杂乱的物理化学进程,从晶体成核和成长开端,然后是集合、晶体粘附在肾小管细胞上,并内化为肾上皮细胞 [ 4]。一切这些进程都发生在包含促进剂和按捺剂的杂乱环境中 [ 5 ],当晶体成核、成长并保存在肾脏内时,它们会导致肾上皮细胞受伤,然后发生结石 。高浓度的 CaOx 晶体或草酸盐自身会导致对肾细胞的毒性效果,然后诱导细胞外表改动,然后提醒肾上皮细胞粘赞同/或内化晶体的附着位点[ 7-8 ]。草酸盐和/或晶体与肾小管上皮细胞之间的相互效果是结石构成的重要要素 [ 9 – 11 ]。此外,肾脏露出于草酸盐会导致活性氧产品,随后发生脂质过氧化和细胞结构、生理学、基因表达和细胞逝世的改动 。

  草酸钙 (CaOx) 晶体一般以不同的办法存在:草酸钙一水合物 (COM)、二水合物 (COD) 和稀有的三水合物 (COT) [ 14 ]。据报导,COM 晶体办法在尿石症发病机制中更风险,因为它们对肾小管细胞具有更大的亲和力 [ 15-16 ],而 COD 办法也经常在健康受试者的尿液中发现 [ 17 ]。现在有多种针对尿石症的疗法,患者一般一起承受其间一些疗法(外科手术、药物和饮食)。关于患者的频频复发,这些都不是彻底有用的 [ 18 – 21]。虽然在此类医治方面取得了开展,但问题仍有待处理 [ 22 ],假如没有有用的医治办法,植物疗法和药用植物的运用将被视为一种有价值的支撑 [ 23 – 24 ] 以供给一些缓解。历史上,药用植物因其抗结石活性而被用作医治药物 [ 2]。不幸的是,大多数这些植物的效果机制不为人知,因而有必要确认活性成分及其抗结石机制。多项研讨发现,药用植物在尿石症的不同阶段发挥抗尿石效果,其药理效果类型也不同。这些植物还显现出镇痛和抗炎特性以及抗氧化、解痉、收敛、结晶按捺、利尿和溶石效果。还证明,药用植物能够改动尿液中的离子浓度,添加镁和柠檬酸盐的分泌,或下降钙和草酸盐的浓度 [ 2 , 24 – 26]。这些草药和植物中的大多数被用作弥补和代替医学的提取物,也可作为药物研讨的潜在候选药物的风趣来历。Ceterach officinarum Willd。(近义词Asplenium ceterach L 或Ceterach officinarum DC)是一种一般被称为“锈背”的蕨类植物,是归于 Aspleniaceae 的一种自生多年生草本植物,广泛散布于西欧和中欧,包含地中海区域。它的特点是根茎短,长出绿色的叶状体,叶状叶片仅在反面有橙棕色的毛状体,因而得名。它成长在碳酸盐岩的裂缝中以及石墙和砖墙之间。C. _ 铁皮地上部分广泛用于传统医学,其成分包含矿藏盐、粘液、单宁、黄酮类化合物、咖啡酸和绿原酸。28 - 30 ]。其地上部分的 Tisanes 用作抗高血压和肝脏抗炎剂 [ 31 ],而汤剂用作祛痰剂 [ 32 ]。C. _ officinarum茶在意大利南部传统上因其利尿特性和医治肾结石而被运用,因而在该区域,它也被称为“碎石剂”[ 33 ]。据报导,地上部分的煎剂能够消除肾结石 [ 34 ] 但这种抗结石效果的实践机制仍不清楚。本研讨旨在研讨C的抗锂化才能。厚朴水提物在结石构成的不同阶段,其或许的机制和对人肠细胞体外模型的影响,以评价C的潜在医治用处。officinarum用于医治和/或防备 CaOx 肾结石。

  C的总多酚含量。officinarum AE 是经过运用 Singleton 等人 (1999) [ 35 ] 稍作修正 [ 36 ]描绘的 Folin–Ciocalteu 办法分光光度法测定的]。提取物在 80% 乙醇中恰当稀释;将越来越多的样品参加蒸馏水中,到达 100 μl 终体积,并与 50 μl Folin–Ciocalteu 试剂混合;运用了仅含水的试剂空白。在室温下放置 3 分钟后,参加 300 μl 20% (w/v) 的碳酸钠,并用蒸馏水将体积调至 1 ml。运用的 AE 浓度规模为 22–110 μg dw/ml。将试管涡旋混合 15 秒并在室温下静置 30 分钟以显色,然后以 10,000 rpm 的转速离心 10 分钟。在 725 nm (Uvikon 分光光度计) 丈量上清液吸光度。2 = 0.9973)。测定C中总黄酮浓度的办法。officinarum AE 是一种改善的氯化铝比色法 [ 37 ] 计划,经过一些修正并针对 96 孔微量滴定板中的丈量进行了调整。简而言之,将 25 μl 恰当稀释的 AE 添加到 5 μl 10% AlCl 3、5 μL 1M CH 3 COOK 和 215 μl 水中。在 405 nm 处丈量混合物的吸光度。一切丈量一式三份进行。运用槲皮素浓度规模为 0.1 至 0.5 mg/ml (R2 = 0.9964) 取得的规范校准曲线,总黄酮类化合物标明为每克 AE 干物质中槲皮素当量的毫克数 (QE)。

  依据 Bradford 染料试剂(考马斯亮蓝 G-250),运用 BSA 作为规范,经过 Bio-Rad 蛋白质测定法对蛋白质浓度进行量化 [ 40 ]。

  在存在和不存在C的情况下进行 CaOx 结晶。厚朴AE。如 Mittal 等人所述,运用光密度的时刻进程丈量来研讨 CaOx 的结晶。溶液 A 和 B 保持在 37°C。随后在 3ml 玻璃比色皿中参加:950 μl Sol. A,在 100 μl 终究体积中参加蒸馏水和 950 μl Sol B 逐步添加的 AE 等分试样,以到达 5.0 mM 钙和 0.5 mM 草酸盐的终究测定浓度。运用的浓度规模为 125–1000 μg AE dw/ml 反响混合物。接连拌和终究溶液并保持在37°C。在 620 nm (Uvikon 分光光度计) 的吸光度下丈量晶体悬浮液的浊度。经过在 50 分钟内每 30 秒记载一次吸光度来取得晶体构成的速率。AE 对 CaOx 结晶的影响以蒸馏水为空白进行了评价。一切结晶试验至少一式三份进行。

  在存在和不存在C的情况下,经过光学显微镜查询到 CaOx 结晶。厚朴AE。在 24 孔板的孔中顺次放置:475 μl CaCl 2原液、逐步添加等分的 AE(终究体积为 50 μl 的蒸馏水)和 475 μl Na 2 C 2 O 4原液,以便别离取得 5.0 mM 钙和 0.5 mM 草酸盐的终究浓度。运用的提取物浓度规模为 1 至 1000 μg dw/ml。含有 50 μl 蒸馏水而不是 AE 的样品用作参阅对照体系。将板置于室温下,然后经过光学显微镜在不同的扩大倍数下查询(Olympus ) 并依据晶体巨细、形状和丰度进行定性剖析。图片由 ToupTek ToupView 版别处理。3.7.

  如“CaOx 结晶剖析”中所述制备并保持在室温下的储藏溶液用于表征在存在和不存在C的情况下发生的 CaOx 晶体的结晶相。XRPD 的officinarum AE。为此,顺次放置:950 ml CaCl 2溶液、100 ml 蒸馏水或 EA 和 950 ml Na 2 C 2 O 4溶液,终究浓度别离为 5.0 mM 钙和 0.5 mM 草酸盐。用玻璃棒悄悄拌和反响混合物并在室温下放置150分钟。运用 0.45 μm 硝酸纤维素膜过滤器过滤混合物。取得的粉末在室温下枯燥并用于XRPD剖析。

  XRPD 矿藏学剖析运用 Philips XChange PW 1830 衍射仪(Cu-Kα 辐射)进行。经过悄悄手艺破坏 CaOx 晶体来制备随机取向的粉末。然后将粉末侧装到铝支架中以查看未取向的粉末,随后以 0.02° 步长进行剖析,计数时刻为 1 秒/步,从 2° 到 65° 2θ。剖析条件为 35 kV 加快电位和 30 mA 灯丝电流。一切首要峰都在细化中被索引,石英作为内标。

  在“光学显微镜查询”部分中陈述的 CaOx 晶体在室温下堆积在碳盘上 24 小时,然后经过装备能量色散 X 的环境扫描电子显微镜 (ESEM) FEI Quanta 200 FEG 进行研讨用于微量化学剖析的射线光谱仪 (EDS)。操作条件为 30 kV 加快电压、10 mm 作业间隔、0° 倾斜角和可变光束直径。ESEM 在低真空办法下运用,样品室压力设置为 0.80 至 0.90 mbar。运用背散射电子检测器取得图画。在存在和不存在C的情况下,在 CaOx 结晶测定中发生的晶体的形状学数据(数量、巨细和形状)。厚朴经过对几个 ESEM 图画中可见的一切晶体的精确查询和丈量来搜集 AE。这些图片是依据两个首要规范挑选的:(i)代表每个查询样本的总面积,以及(ii)进行很多丈量。

  还经过原子力显微镜(AFM)研讨了晶体形状和尺度。简而言之,将如上所述取得的 50 μl CaOx 晶体分层在玻璃外表上并经过氮气流枯燥。本研讨运用 XE-100 原子力显微镜(AFM;PARK Systems Inc.);该仪器装备了由 XEP 1.8.1 软件操控的 50μm 扫描仪。AFM 设置为非触摸办法,X-Y 阶段处于闭环和高压办法。Z 扫描仪设置为闭环和高压办法,分辨率设置为 1.8Å。大图画的速度扫描为 0.25Hz,1x1μm 搜集的速度扫描为 1Hz。本研讨中运用的顶级是 NCHR 类型,标称绷簧常数为 42 N/m,典型谐振频率在 250 和 300kHz 之间。数据搜集在受控温度的空气中进行。除了地势之外,还取得了起伏和相位信号。振幅信号被用作 Z 反响电路的共同驱动,然后使相位信号彻底取决于外表的化学和纳米机械特性。相位信号评价(相位检测显微镜 PDM)是经过运用 1x1μm 扫描区域对 CaOx 颗粒随机进行的,每种条件剖析了大约 25 张图画。运用 XEI 软件 (PARK Systems Inc.) 剖析 AFM 图画。相位信号评价(相位检测显微镜 PDM)是经过运用 1x1μm 扫描区域对 CaOx 颗粒随机进行的,每种条件剖析了大约 25 张图画。运用 XEI 软件 (PARK Systems Inc.) 剖析 AFM 图画。相位信号评价(相位检测显微镜 PDM)是经过运用 1x1μm 扫描区域对 CaOx 颗粒随机进行的,每种条件剖析了大约 25 张图画。运用 XEI 软件 (PARK Systems Inc.) 剖析 AFM 图画。

  在玻璃烧杯中顺次放置:475 ml Sol A、50 ml 蒸馏水或 EA 和 475 ml Sol B,如前所述,终究浓度别离为 5.0 mM 钙和 0.5 mM 草酸盐。用玻璃棒悄悄拌和反响混合物并在室温下放置150分钟。除 100 ml 外,混合物运用 0.45 μm 硝酸纤维素膜过滤器过滤。从过滤器外表搜集晶体并添加到未过滤的 100 ml 中。将该悬浮液以 5,000 rpm 离心 10 分钟并弃去上清液。将堆积从头悬浮在 50 ml 2 M HCl pH 0.6 中,经过对草酸盐的效果使 COD 晶体溶解。将晶体外表粘附组分装入具有 3,500 kDa MWCO(截留分子量)的透析管中,并用蒸馏水透析过夜。将透析样品的等分试样枯燥过夜并用于测定干重(0.2 mg dw/ml)。将枯燥的粉末恰当地从头悬浮在蒸馏水中,用于随后的活性表征剖析。

  数据标明为至少三个独立试验的均匀值±SD,并运用单要素方差剖析进行剖析,然后运用 Kruskal Wallis 查验进行多重比较剖析或非参数 Mann-Whitney U 查验。P 0.05被以为是明显的。AFM 样品数据之间的核算比较选用 Dunnett 的多重比较查验,仅陈述与对照样品的比较。细胞试验中的核算剖析经过双向方差剖析进行,然后进行过后Bonferroni 测验。P 0.05 的置信水平用于核算明显性。

  成果是超越 3 次不同试验的均匀值 ± SD。依据 Kruskal Wallis 查验和 Dunn 后查验揣度,每个样本的中值都不同于其他样本 (p0.05)。

  50 μl C. 经过 HPLC 剖析officinarum AE,如“资料和办法”部分所述装备。经过与剖析规范品比较,在 HPLC 色谱图中判定了产品。据报导图2,色谱图的主峰(保存时刻8.97 min)为绿原酸。

  经过用作浊度估量的620nm (A 620nm )处的吸光度丈量构成的晶体数量。在该测定体系中,A 620nm是衡量每单位体积颗粒浓度的杰出目标,因而 A 620nm的添加首要反映了颗粒数量随时刻的添加。因而,A 620nm的最大添加斜率,称为成核斜率 (S N ) 并由线性回归剖析确认,首要代表新粒子构成的最大速率,然后标明晶体成核。对照试验中 A 620nm的时程丈量遵从从前报导的典型曲线, C. _ officinarum AE 对 CaOx 结晶有促进效果;AE 发生的成核影响百分比,核算为 [(S N AE - S N c) / S N c] × 100(其间“c”代表对照)跟着提取物浓度的添加而以剂量依靠性办法添加从 125 到 1000 μg AE dw/ml。

  成果是超越 3 次不同试验的均匀值 ± SD。依据 Kruskal Wallis 查验和 Dunn 后查验揣度,每个样本的中值都不同于其他样本 (p0.05)。在对照试验中,在到达 A 620的最大添加后,因为晶体集合 [ 46 ] 而在存在C的情况下,虽然接连拌和,但仍查询到吸光度逐步下降。officinarum AE 没有查询到这种下降。因为C的存在,对照样品中的晶体集合和这种现象的彻底按捺。ESEM剖析清楚地显现了officinarum AE(S1图)。

  CaOx 在存在和不存在C的情况下结晶。如“资料和办法”部分所述,还经过光学显微镜剖析了officinarum AE。在对照体系中,培育 24 h 后取得的显微照片显现构成了两种类型的 CaOx 晶体:具有单斜棱柱形或孪晶形的很多 COM 晶体,只要少量具有典型双锥体形状的 COD 晶体(图 4A 和 4B)。COM 和 COD 晶体都很大,COM 呈现出大致斜方结构,具有高度多面的 {100} (图 4A) 和 {010} 人脸 (图 4B)。添加C。将厚朴提取物参加到反响混合物中会导致所发生晶体的结构、数量和巨细发生改动。AE 浓度现已到达 0.9–2 μg dw/ml (图 4C) 构成的粒子数量略多,其间大部分依然是 COM。与对照组比较,这些 COM 晶体更小,数量简直折半;但是,{100} 和 {010} 双晶面因为微观台阶的存在而高度刻面,并且更小、更不规矩的形状标明正在进行的成长动力学。跟着提取物浓度添加到 15-30 μg dw/ml (图 4D),COM晶体数量更多,体积更小,更薄,形状更规矩,润滑的{100}面上有明显的洼陷,而COD晶体依然很少见,中等巨细。如图所示图 4E,在 60–125 μg dw/ml COD 晶体存在时,依然是中等巨细,变得更多,而 COM 晶体更多,更小,更薄,具有圆形边际,有时呈哑铃形或新月形,或许是因为到润滑的{100}面上的深深洼陷。在高达 130–200 μg dw/ml (图 4F),晶体数量明显添加,简直都是中小型COD晶体,只要偶然的COM晶体。C浓度较高。officinarum AE 500 至 1000 μg dw/ml (图 4G 和 4H) 显现了 COD 办法的仅有存在。跟着提取物浓度的添加,构成的 COD 晶体的数量以剂量依靠性办法添加,一起查询到 COD 的巨细逐步减小,最高浓度导致很多细小晶体的构成。

  图 4在不存在和存在C的情况下成长的 CaOx 晶体的光学显微照片。officinarum AE 浓度添加。

  运用文献 [ 47-49 ]中可用的晶体学特征(习性、晶面之间的视点、晶体对称性等)描绘堆积物的晶相和形状。晶体的形状清楚地标明,各种习性(形状和办法)与从 XRD 数据评价的草酸钙的水合状况密切相关。依据 ESEM 查询 (图 6),简直一切 CaOx 晶体在没有C的情况下堆积。officinarum AE 是一水草酸钙 (COM) 单晶,具有板状习性。它们首要呈现面形松果体{100}、{010}和棱镜。pinacoids {100} 和 {010} 一般是首要办法,别离具有菱形和平行四边形的形状。这些COM单晶的均匀尺度为长8.2 μm({001}维)、宽4.4 μm({010}维),一般高1-2 μm({100}维)。在这些首要的形状类型中,还有过渡形状和穿透孪生。构成的穿透孪晶从 {010} 和 {100} 面成核(图 6A 和 6B)。这些晶体具有杰出的刻面,具有 {100}、{010} 和 {121} 面。还查询到从渗透到多孪生、超孪生和很少到超孪生集合体的改动(图 6C 和 6D)。超/超双胞胎的晶体习性倾向于呈现圆润的 {100}/{121} 边际(图 6D)。在没有C的情况下,二水草酸钙 (COD) 晶体十分稀有。officinarum AE,而未检测到三水合物 (COT) 或无定形相。

  图 6在不存在 (ad) 或存在 (e, f) 不同浓度C的情况下取得的各种形状类型 COM 和 COD 的扫描电子显微照片。厚朴AE。(a) 从 [ 1 ] 方向查询的孪晶 COM 晶体。(b) 单晶和双晶 COM 晶体。(c) 从 [ 10 ] 方向查询的双孪晶 COM 晶体。(d) 超孪晶和超孪晶 COM 晶体,构成花状集合体。(e) 在 500 μg dw/ml AE 存鄙人的单个四方双锥 COD 晶体;(f) 在 1000 μg dw/ml AE 存鄙人,单独四方 COD 晶体和扁平 COD 晶体的小穿透孪晶。相反,在C浓度添加的情况下,晶体形状发生了明显改动。药用AE (图 6E500微克干重/毫升;图 6F1000 μg dw/ml AE)。分出的 COM 的总体积急剧削减直至消失,而 COD 晶体成为排他性物种的优势。COD晶体的典型办法如图所示图 6E 和 6F. 它们具有 COD 的经典晶体习性,由以 {101} 面为主的单个四方双锥体为代表,沿晶体 c 轴的均匀边长约为 6.5 μm,边长约为 1 μm(图 6E)。一切这些双锥体的特点是没有棱柱形 {100} 面,使晶体具有十分扁平的形状。在更高扩大倍数的 ESEM 图画中(图 6F),部分穿透孪晶的构成在较小的扁平四方双锥体中很明显。

  查询在不存在和存在不同浓度C的情况下取得的不同 CaOx 堆积物的 ESEM 图画。药用AE (图 7),晶体尺度的逐步减小伴跟着它们的数量的添加明显呈现。没有C时晶体的均匀尺度 (COM) 。officinarum AE 为 8.2 μm(长度)。在 200 μg dw/ml 的C存鄙人,晶体尺度 (COD) 略有添加。officinarum AE(均匀长度为 9.93 μm),而从 500 μg dw/ml 经过时会发生明显的尺度减小。(均匀长度 6.43 μm)至 1000 μg dw/ml(均匀长度 3.69 μm)的 AE。这种晶体尺度的减小伴跟着每单位面积晶体总数的明显添加,在没有C的情况下均匀到达 47 个晶体/单位面积。厚朴在 AE 的最大浓度 (1000 μg dw/ml.) 存鄙人,AE 到达 393 个晶体/单位面积。

  在不存在或存在不同浓度C的情况下取得的 CaOx 晶体的扫描电子显微照片(上)和形状/数量数据(下)。厚朴AE。

  相位信号剖析还提醒了对照与 50 μg dw/ml、100 μg dw/ml 和 1000 μg dw/ml AE 处理的 CaOx 溶液之间的明显核算学差异(图 10)。这标明当 AE 存在时,外表的化学物理性质会发生改动。这或许是因为 AE 组分粘附到晶体外表,然后改动了外表化学性质。

  选用 Dunnett 的多重比较查验来验证样品之间的核算差异,并且只陈述与对照的比较。*** P 0.01。

  在图 11三个样品的代表性相位图画显现对照样品外表不存在球状结构(图 11A),而它们是在 50 μg dw/ml C中查询到的。officinarum AE 样品在 1000 μg dw/ml 样品中尺度添加(图 11B 和 11C)。

  该图显现了 AE 组分对 CaOx 晶体外表的或许影响。与对照样品 (A) 比较,在 50 μg dw/ml C存鄙人。officinarum AE (B) 在存在 1000 μg dw/ml C的情况下,呈小球状,尺度添加。厚朴AE (C)。古怪的现象是 50 μg AE 样品(与对照比较相位成果添加)与 100 μg 和 1000 μg AE 样品(与对照比较相位信号明显下降)之间的相位改动不同,如图所示图 10. 咱们假定这种现象不只取决于C或许的外表附着力。officinarum AE 成分,但也影响其对晶体成长方向的影响,然后露出出不同的外表化学基团,这或许会改动相位信号。事实上,经过起伏信号研讨,能够精细地研讨外表的纳米和亚纳米安排 [ 50 ],并且咱们能够标明依靠于C的 CaOx 亚结构的改动办法。药用AE 浓度 (图 12)。或许在 50μg dw/ml 时,相位信号首要受改动的 CaOx 亚结构取向的影响,而在较高浓度时C的吸赞同相互效果。具有晶体外表的officinarum AE 成分变得占主导地位。

  为了验证晶体外表组分的特异性结合(如资料和办法部分所述溶解)影响整个C查询到的 CaOx 结晶的改性的假定。officinarum AE,进行光学显微镜查询。

  CaOx 结晶显微照片在不存在和存在这些组分的情况下以添加的浓度孵育 24 小时后显现,与对照比较,它们诱导晶体结构、数量和巨细的改动(图 13A 和 13B)。浓度已到达 1.2 μg dw/ml (图 13C) 能够验证 COM 角的细微倒圆;这种趋势在浓度添加到 2.3 μg dw/ml 时愈加杰出(图 13D) 和 4.7 μg dw/ml (图 13E 和 13F),晶体简直都是中大型 COD。但是,虽然很少见,但依然查询到一些圆形的 COM 晶体,十分厚且呈孪晶办法。从 9.4 μg dw/ml (图 13G) 高达 18.7 μg dw/ml (图 13H) 与 COD 表格的仅有存在有关。这些 COD 晶体的数量逐步添加,尺度相应减小,呈剂量依靠性。

  图 13在不存在和存在C的情况下成长的 CaOx 晶体的光学显微照片。officinarum溶解的组分在添加的浓度。

  肾结石依然是一个全球性的公共卫生问题,因为它影响了国际 1-20% 的成年人口。CaOx 是肾结石的首要成分,CaOx 晶体沿泌尿道堆积,依靠于过饱和,代表了结石构成的首要条件 [ 26 ]。因为晶体停留也已被证明是结石生成的关键要素 [ 6-11 ],因而搅扰 CaOx 结晶和停留进程可为防备和操控复发性结石构成供给有用的医治办法。越来越多的依据 [ 33 , 34 ] 标明C的有利效果。officinarum水提物 (AE) 用于医治肾结石,但虽然如此,人们对C的实践机制知之甚少。officinarum抗结石效果。此外,除了尿液过饱和的条件和有利环境的呈现外,结石的构成还有许多进程,不同的抗尿石植物在尿石症的不同阶段发挥效果。特别是,许多植物提取物经过避免氧化应激的发生而具有明显的抗锂活性 [ 51 – 53]。一种解说与 COM 乳头状结石的构成有关,占泌尿系结石的 13%,而在肾腔中构成的 COM 结石占肾结石的 16%。COM 乳头状结石的开展与肾乳头的初始上皮下钙化有关,羟基磷灰石堆积取决于预先存在的触及活性氧和氧化应激的损害 [ 51 , 53 ]。酚类化合物,如黄酮类化合物、酚酸和单宁,被以为首要担任植物的抗氧化才能。

  咱们的成果证明晰C . officinarum AE 也是一种丰厚的抗氧化剂来历,经过 DPPH •自由基铲除试验评价具有重要的抗氧化活性。图。1)。分光光度法测定总酚类和黄酮类化合物的含量,以及 HPLC 剖析(图2),标明C . officinarum水提取物包含升高水平的酚类成分,因而这些植物化学物质对C . 不能扫除officinarum AE 抗结石活性。咱们的数据证明晰C的首要影响。officinarum水提取物对体外诱导的草酸钙结晶动力学和晶体形状的影响,对保存进程有明显影响,指出在肾结石构成和/或消除中的关键效果。

  更具体地说,在分光光度剖析中,跟着提取物浓度的添加,A 620nm的添加标明晶体数量的添加与剂量相关,因为 A 620nm高度依靠于新晶体的生成,即成核进程自身(图 3)。但是,在较小程度上,A 620nm也与晶体尺度有关[ 26 , 46 ]。事实上,光学显微镜查询标明添加C . officinarum AE 对结晶体系的影响不只按捺了 CaOx 晶体的堆积,并且跟着提取物剂量的添加,实践上诱导了更多的晶体,虽然发生的晶体逐步小于对照样品中的晶体,呈剂量依靠性。图 4)。此外,在C存鄙人,由分光光度计丈量和在 ESEM 剖析中查询到的对照样品中的晶体集合遭到按捺。officinarum AE(S1 图)。这些效果现已足以在防备结石症、按捺晶体成长和集合以及随后按捺结石构成方面供给明显优势,然后更简单随后经过尿道消除十分小的涣散晶体。但是,咱们在C的效果中取得了额定的重要成果。officinarum AE 在防备结石症中的效果。首要,咱们的微观剖析证明晰C . 厚朴AE 改动 COM 晶体形状:在 60-120 μg dw/ml 的规模内,AE 诱导 COM 晶体的构成,其特征是 {100} 外表洼陷和圆角界面角,促进 COM 从六角形改动为球形形状,以一种让人想起柠檬酸盐和 Mg 2+ [ 54 ] 以及各种其他植物提取物(包含Terminalia arjuna和 cystone [ 55 ] )的前期陈述的办法。也是Phyllantus niruri的 AE ,一种在巴西民间医学中广泛食用的大戟科植物,并因其在医治尿石症中的有利效果而被广泛研讨 [ 56],当经过咱们的试验计划进行测验时,在 CaOx 一水合物晶体中引起了类似的形状修正(S2 图)。特别是关于柠檬酸盐,一种众所周知的草酸钙结石构成按捺剂,Shang 等人。[ 57 ] 标明,CaOx 结石患者口服柠檬酸钾导致尿液 COM 晶体外表呈现洼陷,然后呈现凹形,边际圆钝,一起尺度减小。据报导,这些圆形 COM 晶体在热力学上不太安稳,与六角形 COM 晶体比较,它们对细胞肾膜的亲和力下降,对这些细胞的粘附性更低 [ 55 ]。这些形状润饰的 COM 晶体能够更简单地经过尿路分泌,然后避免肾结石的发生。

  其次,更风趣的是,咱们经过光学显微镜和 ESEM 的查询成果(图6和7) 杰出显现C。浓度为 120-500 μg dw/ml 的厚朴AE 促进草酸钙二水合物而非一水合物晶体的构成,因而终究,在 500-1000 μg dw/ml 之间,仅查询到 COD,并且这些晶体逐步变小,在剂量依靠性办法。与 COM 晶体比较,COD 晶体不太或许粘赞同保存在肾细胞外表,因而对肾小管上皮细胞的损害较小。在Phillantys niruri水提取物存鄙人,咱们查询到 COM 晶体明显削减,一起 COD 晶体添加( S2 图)。还有尚等人[ 57] 查询到柠檬酸盐将 COM 转化为专门的 COD 晶体,并将这一事情归因于 Ca 2+离子与柠檬酸盐络合构成具有高溶解度的螯合物。这种螯合效果能够缓慢溶解导致呈现洼陷的晶体。溶解的Ca 2+离子不断地从头堆积在CaOx 晶体外表,这种接连的溶解-堆积会引起COM 的形状改动并转化为COD。咱们经过 AFM 进行的额定查询(图8–10) 进一步证明晰C . officinarum AE 对形状学参数和运用光学显微镜和 ESEM 描绘的 COM 和 COD 晶体总数的剂量依靠性影响。此外,依据 AFM 剖析的这些成果,咱们能够证明,与对照样品相反,在C存鄙人取得的晶体。officinarum AE 在其外表呈现出小球状形状,这些形状以剂量依靠性办法变大(图 11)。这些数据激烈暗示了C的吸附。晶体外表上的officinarum AE 组分是导致所述晶体润饰的或许要素。但是,样品 50 μg dw/ml AE 与样品 100 μg 和 1000 μg dw/ml AE 之间不同的相位改动标明C . officinarum AE 不只经过其组分相互效果(一种好像在较高浓度下占主导地位的机制)发挥上述效果,并且在较低浓度下,好像当即移动特定的外表化学基团,然后改动相位信号(图 10); 它或许导致影响晶体成长方向,这能够从重构的 CaOx 晶体外表的纳米和亚纳米结构中合理地揣度出来(图 12)。

  这些成果与其他作者 [ 58 – 59 ] 从前 AFM 研讨的成果共同,这些研讨触及特定调节剂吸附在晶体外表对 CaOx 晶体成长的影响。依据 AFM 成像评价,Guo 等人。[ 58 ] 证明晰阴离子聚合物如聚天冬氨酸 (polyD) 和聚谷氨酸 (polyE) 经过其官能团(别离为天冬氨酸和谷氨酸残基)在不同的 COM 晶体外表上的吸附不同地改动了吸附机理COM 晶体成长好像发生了。此外,De Yoreo 等人。[ 59 ] 经过 AFM 剖析验证了晶体和成长调节剂如柠檬酸盐和骨桥蛋白 (OPN) 之间的特定相互效果的关键效果。关于吸附在晶体外表上的假定 AE 活性成分的存在(图 11) 咱们决议运用 COD 晶体的增溶程序将它们分离出来,在这些晶体上这些成分更明显。这样的战略使咱们能够取得一个与 AE 的活动十分类似的样本。在不存在和存在添加浓度的这些组分的情况下孵育 24 小时后取得的 CaOx 结晶显微照片标明,事实上,它们经过更圆润的 COM 诱导了典型办法的 COM 晶体的结构、数量和巨细的改动晶体,以剂量依靠性办法彻底转化为数量添加而尺度逐步减小的 COD 晶体(图 13)。总归,在这项体外研讨中,咱们标明C. officinarum AE 除了具有高抗氧化才能外,仍是一种有用的 COM 成长和集合按捺剂。此外,它在影响晶体成核方面十分有用,导致 COM 晶体数量明显添加,相应的 COM 晶体尺度明显减小,变得越来越薄、越来越圆、越来越凹;这些较小且形状经过润饰的 COM 晶体被以为粘附性较差,更简单经过尿路分泌,然后避免肾结石的发生。更重要的是,C . 厚朴. 超越低浓度阈值的 AE 促进草酸钙二水合物而不是一水合物的构成,以剂量依靠性办法进一步减小 COD 晶体的巨细。因为 COD 晶体的吸附才能最低,本文报导的成果或许激烈支撑C的维护效果。officinarum AE 对肾结石的构成。咱们验证C吸附的才能。润饰的 COM 和在 AE 浓度升高的情况下发生的 COD 晶体外表上的officinarum活性成分标明晰一个假定的触发要素,该要素或许将晶体润饰导向 COD 办法,如图所示图 14.

  该图标明来自C的活性成分的逐步粘附。晶体外表上的officinurum作为一个假定的触发要素,辅导从 COM 到 COD 办法的晶体润饰。(A):操控;(BD) 逐步添加C的剂量。药用AE。

  依据这些数据,以及对人类分解的 CaCo 细胞系没有明显毒性,该细胞系被广泛用作肠上皮屏障的模型 [ 41 ],C . 厚朴。水提取物能够代表一种有吸引力的尿石症天然代替疗法。

  在不久的将来,咱们计划辨认和表征这种晶体成长调节剂,为此,咱们现已开端了进一步的广泛研讨,以协助咱们终究说明C的积极效果和好处的潜在机制。铁皮医治尿石症。

  在不存在 (A) 或存在 (B) 1000 μg dw/ml C的情况下取得晶体。厚朴AE。一般在对照样品 (A) 中查询到晶体集合的依据,而在存在提取物 (B) 时它们彻底不存在。(TIF)

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